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          技術支持

          葡聚糖凝膠層析操作步驟

          更新時間:2021-04-26   點擊次數:2408次

          1.凝膠的預處理

          交聯葡聚糖凝膠的市售商品多為干燥顆粒,使用前必須充分溶脹。方法是將欲使用的干凝膠緩慢地傾倒入5~10倍的去離子水中,參照相關資料中凝膠溶脹所需時間,進行充分浸泡,然后用傾倒法除去表面懸浮的小顆粒,并減壓抽氣排除凝膠懸液中的氣泡,準備裝柱。在許多情況下,也可采用加熱煮沸方法進行凝膠溶脹,此法不僅能加快溶脹速率,而且能除去凝膠中污染的細菌,同時排除氣泡。

          2.裝柱

          層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時,柱床體積應為樣品體積的25~100倍。去除鹽及游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太短,影響分離效果。柱長一些,分離效果好,但柱太長,則延長分離時間,樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細,會發生“器壁效應”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為1︰5~1︰25;對于純化蛋白質來說應為1︰20~1︰100。

          凝膠柱的裝填方法和要求,基本上與離子交換柱的制備相同。一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致,沒有空隙和氣泡。通常新裝的凝膠柱用適當的緩沖溶液平衡后,將帶色的蘭葡聚糖–2000、細胞色素,或血紅蛋白等物質配制成質量濃度為2g/L的溶液過柱,觀察色帶是否均勻下移,以鑒定新裝柱的技術質量是否合格,否則,必須重新裝填。

          3.加樣與洗脫

          (1)加樣量:加樣量與測定方法和層析柱大小有關。如果檢測方法靈敏度高或柱床體積小,加樣量可??;否則,加樣量增大。例如利用凝膠層析分離蛋白質時,若采用28Onm波長測定吸光度,對一根2cm×6Ocm的柱來說,加樣量需5mg左右。一般來說,加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高),分辨率越高。通常樣品液的加入量應掌握在凝膠床總體積的5%~10%。樣品體積過大,分離效果不好。

          對高分辨率的分子篩層析,樣品溶液的體積主要由內水體積(Vi)所決定,故高吸水量凝膠如Sephadex G-200,每mL總床體積可加0.3~0.5mg溶質,使用體積約為0.O2倍總體積;而低吸水量凝膠如Sephadex G–75,每mL總床體積加溶質質量為0.2mg,樣品體積為0.Ol倍總體積。

          (2)加樣方法:如同離子交換柱層析一樣,凝膠床經平衡后,吸去上層液體,待平衡液下降至床表面時,關閉流出口,用滴管加入樣品液,打開流出口,使樣品液緩慢滲入凝膠床內。當樣品液面恰與凝膠床表面持平時,小心加入數mL洗脫液沖洗管壁。然后繼續用大量洗脫液洗脫。

          (3)洗脫:加完樣品后,將層析床與洗脫液儲瓶、檢測儀、分部收集器及記錄儀相連,根據被分離物質的性質,預先估計好一個適宜的流速,定量地分部收集流出液,每組分一至數mL。各組分可用適當的方法進行定性或定量分析。

          凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液,有時甚至可用蒸餾水。洗脫時用于流速控制的裝置*的是恒流泵。若無此裝置,可用控制操作壓的辦法進行。樣品體積不宜過多,*為床體積的1%~5%,蕞多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大,濃度過大粘度大,分離效果差,一般不超過4%。

          洗脫液應與膨脹一致,否則更換溶劑,凝膠體積會發生變化,影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。

          凝膠再生和保存

          凝膠層析的載體不會與被分離的物質發生任何作用,因此凝膠柱在層析分離后稍加平衡即可進行下一次的分離操作。但使用多次后,由于床體積變小,流動速率降低或雜質污染等原因,使分離效果受到影響。此時對凝膠柱需進行再生處理,其方法是:先用水反復進行逆向沖洗,再用緩沖溶液平衡,即可進行下一次分離。

          對使用過的凝膠,若短時間保存,只要反復洗滌除去蛋白質等雜質,加入適量防腐劑即可;若長期保存,則需將凝膠從柱中取出,進行洗滌、脫水和干燥等處理后,裝瓶保存。

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