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          技術支持

          葡聚糖凝膠柱(sephadex column)使用及注意事項

          更新時間:2021-09-14   點擊次數:3653次

           

           

          1 Sephadex G型葡聚糖凝膠只適合在水中使用,Sephadex G-25羥丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子篩作用,在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價位很高,但由于性能頗佳,可再生利用,所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少,對處理小樣品較好,這也是我們實驗室常用的原因之一。

          2 Sephadex LH20 的原理。
          Sephadex LH20的分離原理主要有兩方面:以凝膠過濾作用為主,兼具反相分配的作用(在反相溶劑中)。因為凝膠過濾作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脫下來,小分子的化合物保留強,最后出柱。如果使用反相溶劑洗脫, Sephadex LH20對化合物還起反相分配的作用,所以極性大的化合物保留弱,先被洗脫下來,極性小的化合物保留強,后出柱。如果使用正相溶劑洗脫,這主要靠凝膠過濾作用來分離。

          3 Sephadex LH20 洗脫溶劑。
          看完第2點后,就應該清楚Sephadex LH20 洗脫溶劑因分為兩類:反相和正相兩種。用得最多的是反相溶劑洗脫,以甲醇--水系統最為常見,先用水,逐漸增加甲醇比例,最后用100%甲醇沖柱。正相系統以氯仿--甲醇最為常見,先用50%氯仿--甲醇,逐漸增加甲醇比例,最后用100%甲醇沖柱。

          4 Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。
          如果樣品極性大,這選用反相溶劑洗脫(甲醇--水),樣品用最少體積的甲醇--水(盡可能甲醇少一些)溶解,過濾后,濕法上樣(一定要濾喔!要是把 Sephadex LH20 堵啦,就得將Sephadex LH20 的柱頭部分棄去,很心痛呀)。如果樣品極性小,這選用正相溶劑洗脫(氯仿--甲醇),樣品用最少體積的氯仿--甲醇溶解,過濾后,濕法上樣。

          5 Sephadex LH-20的步驟。

          (1) 選擇條件:
          梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統;極性小者一般用不含水的系統。我們實驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統,用了很多年,效果較好。

          (2) 飽和層析柱:
          用洗脫劑將凝膠搖勻,直立柱身,讓其自然沉降,此時要防止氣泡留在其中。至少半小時打開開關,流出幾個柱體種的洗脫劑,目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。

          (3) 樣品處理:用盡量少的洗脫劑溶解樣品,常壓過濾。

          (4) 濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。

          (5) 洗脫:控制流速,一般1drop/s以下,可參見廠家的一些參數;必要時更改極性(很多時一個極性就可以將樣品洗脫完畢)。

          再生以備下次使用。

          6 分離的技巧,最后說說我的使用心得

          (1) 流速不可太快,切切不可新急,所謂欲速則不達。

          (2)柱子盡可能長, Sephadex LH20 柱長的增加將極大地改善分離,所不要吝惜填料,寧可將填料全裝在一根大柱子中,不要將填料裝成幾根小柱。所謂集中優勢兵力,打擊敵人。

          (3) 餾分一定要接的細,可1/10,或1/20 個保留體積接成一餾分。

          (4) 洗脫體積一般為2-3個保留體積,對特殊保留強的化合物,可洗脫5個保留體積。

          (5)鞣質成分死吸附嚴重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣質。

          (6)Sephadex LH20 對黃酮類成分的分離效果ji佳,方法很成型,有大量文獻參考。

          (7)填料反復使用,每次用完,一般可用甲醇將柱子洗干凈,然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來,待用。

          Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成,屬于分子篩凝膠,尤其適用于天然產物在有機溶劑中的純化。例如:類固醇、萜類、脂類以及小分子多肽等,Pharmadex LH-20同時適用于分子類別非常相似的物質的分離和工業規模的制備,既可用于初步純化步驟,也可用于最終精制步驟,如非對映同分異構體的分離。

          1.裝柱
          裝填的重要原則之一就是需要形成一個穩定均一的柱床。膠顆粒越均一(粒徑分布越窄),越容易獲得穩定均一的柱床。但是對于Sephadex LH-20而言,25~100μm的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言,不能說分布均一,也就是說其粒徑分布較寬。然而當膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長柱(最高至250cm)而言也是同樣的。在裝柱前,層析柱和儲槽都必須進行*的清洗。
          Sephadex LH-20在使用之前必須進行溶脹。在溶脹的過程中,要盡量避免過分攪拌,否則會破壞球形膠粒,且要避免使用磁力攪拌器。
          在室溫下,將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時,溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統,請參考后頁之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%,上層溶劑占25%,這時,懸浮液從一個容器倒入另一容器時膠??梢苿?。將溶脹后的凝膠根據裝柱要求均勻倒入柱內,在保證膠粒不變形的前提下,應在盡可能高的壓力下裝柱,反壓不要超過1.5ba。

          2.平衡
          上樣前,用洗脫液平衡層析柱至少兩個柱體積直到基線變得平穩為止,如改變溶劑應該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質,并根據性質確定柱高調節器的位置,如使用相同的溶劑,在以后的層析中柱平衡可以省略。

          3.洗脫液
          為確保延長層析柱的使用壽命,所有的緩沖液都應該離心或經過0.45um的膜過濾以除去雜質。

          4.樣品
          樣品體積應該占柱總體積的1-2%,同樣在使用之前樣品應該離心或經過0.45um的膜過濾。

          5.洗脫
          洗脫流速應根據情況而定,最大線性流速約12cm/min(反壓1.5ba),建議流速為1-10cm/h??傮w來說,較低的流速,具有較高的分辯率。

          6.再生
          凝膠再生通常是先用2-3個柱體積的洗脫液進行清洗,如更換洗脫液,則需要重新平衡。

          7.體積流速與線性流速的關系
          線性流速=體積流速/橫截面積

          8.溶脹體積
          由于Sephadex LH-20的溶脹體積依賴于溶劑,所以對于不同直徑的柱可根據比例增加或減少舊柱體積以便計算出新體積。
          新體積=舊體積×(新柱體積/舊柱體積)

          9.膠的性質
          Sephadex LH-20同時具備親水和親脂雙重性質,且被分離物質的極性在分離過程中起著重要作用。

          10.排阻極限 4-5KD(與所用溶劑有關)

          11.上樣量
          吸附模式 取決于所需分辯率
          分子量大小 小于總體積的20%
          正相分配 小于總體積的1%

           

           

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