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          技術支持

          瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物

          更新時間:2021-11-01   點擊次數:2038次

            一.原理
            DNA--pian斷的分離與回收是基因工程操作中的一項重要技術,例如可收集特定酶切片斷用于克隆或制備探針,回收PCR產物用于再次鑒定等?;厥諏嶒炛袃蓚€最重要的技術指標是純度和回收率:前者未達標時會嚴重影響以后的酶切、連接、標記等酶參與的反應;后者不理想時往往會大大增加前期的工作量。

            本實驗采用的是V-GENE公司的DNA凝膠回收試劑盒,其原理是:在凝膠融化液(Buffer DE-A)中凝膠塊被迅速融化并釋放出DNA。加入高離液序列溶液(Buffer DE-B)后DNA--pian斷被選擇性吸附到silica膜上。經Buffer W1、Buffer W2洗滌去除殘留在silica膜上的雜質和高濃度鹽離子后,吸附到 silica膜上的DNA--pian斷經微量水或Eluent洗脫下來,即可用于各種分子生物學實驗。

            二.材料與方法
            1 材料
            PCR產物(未經純化)

            2 儀器、用具
            電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、微波爐、臺式離心機、移液器、恒溫孵育器(55-65℃)、1.5ml 離心管

            3 試劑
            1×TAE電泳緩沖液;溴化乙錠溶液(EB)[有毒,小心操作] ;瓊脂糖;6×加樣緩沖液;NJ 緩沖液;DNA洗脫緩沖液;SPW洗滌緩沖液

            2.4 方法
            (1) 按常規方法于2%瓊脂糖凝膠進行電泳。
            (2) 在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠,用紙巾吸盡凝膠表面液體。
            (3) 稱量凝膠重量,以1mg=1μl換算凝膠體積。
            (4) 加入3個凝膠體積的NJ緩沖液
            (5) 懸浮均勻后于55℃-65℃加熱7min,期間每2—3min搖晃一次,直至凝膠塊*融化。
            (6) 把DNA—瓊脂糖溶液加到一個Mu-Pu DNA回收純化柱上,并把柱子裝在一干凈的2ml收集試管內,14000rpm離心1ml,棄去流出液。對于體積大于700μl 的樣品,則分別加到不同的柱子上,每次700μl。
            (7) 用700μl無水乙醇稀釋的SPW洗滌緩沖液洗滌柱子,加入柱子中后靜置2-3min。室溫下14000rpm離心1min。
            (8) 棄濾液,以同樣的方法再洗滌一次。
            (9) 把柱子裝在一個滅菌干凈的1.5ml 離心管上,加入30-50μl的DNA洗脫緩沖液或無菌去離子水到柱基質上,14000rpm離心1min以洗脫出DNA。
            (10) 取3μl樣品,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收結果。

            注:PCR產物的純化選用直接純化法還是膠回收法主要取決于PCR產物。若PCR產物電泳時為單一條帶,可采用直接純化法,即將酶、dNTP等多余物質去掉便可;若PCR產物電泳時為多條帶,則要根據需要回收特定條帶,此時須選用膠回收法。

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