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          技術支持

          ELISA常用檢測法——競爭法原理介紹

          更新時間:2022-05-06   點擊次數:2528次

           做ELISA實驗,有幾種常見的實驗方法,他們分別是競爭法、捕獲法、間接法、夾心法、而夾心法又可以分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法!在今天的文章中,遠慕生物將詳細得跟大家講述競爭法的實驗原理!

          試劑盒 (8).jpg

          競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法,這里我們以直接競爭法為例進行原理講解。直接競爭法,其基本原理是:將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中,加入無關蛋白載體封閉未結合位點,加入標準品(樣本)和生物素標記的抗原物質進行競爭結合,經合適的溫度和一定時間的孵育,洗滌后,加入HRP標記的鏈霉親和素進行反應,TMB顯色,微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負相關。

          該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質,當然,這種方法也可以用來檢測大分子抗原物質甚至是抗體。檢測大分子抗原物質時,由于空間位阻的影響,使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質靈敏度高。這種方法在檢測抗體時,可能由于兩種競爭的抗體來源不一,導致兩種抗體趨同性不高,就使得檢測結果的可靠性不高。

          當抗原材料中的干擾物質不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時,可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多,結合在固相上的酶標抗體愈少,因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的,可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質,直接包被不易成功,可采用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應的抗體,然后加入抗原,形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質,然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式,可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合,洗滌后再加入酶標抗體,與結合在固相上的抗原反應??笻Be的檢測一般采用此法。

          實驗步驟

          以稀釋液將待檢標本做適當稀釋(預試中確定)加入包被有已知抗原的酶標板中(50ul/孔),加封口膠帶于37℃作用30min。

          2.  棄反應液,以沖洗液連續洗板5次并于吸水紙上拍干。

          3.  加入酶標抗體(濃度在預試中確定)。加封口膠帶后于37℃作用30min。

          4.  重復第2步。

          5.  加底物(濃度在預試中確定),加封口膠帶后于室溫下避光作用5-60 min,其間不時觀察,顯色滿意后加終止液50ul/孔。

          6.  于酶標儀測定OD值,OPD用492nm測定,TMB用450nm測定。

          注意事項

          每次實驗均應做陰性對照、陽性對照及空白對照(以PBS代替標本),后者為本底值,在分析實驗結果時應扣除本底值,陽性對照<陰性對照<空白對照實驗成立。

          2.  一般認為小分子抗原宜用本法檢測,而大分子抗原則宜采用夾心法檢測,但具體宜采用哪種方法應根據試驗決定,本發與夾心法相比在操作上減少一步。包被抗體與酶標抗體如果分別采用單克隆抗體和多克隆抗體時,宜用單克隆抗體作為包被抗體,以多克隆抗體作為酶標抗體。

          3.  血清標本中抗原濃度一般較低,故一般用原倍標本進行檢測,必要時可進行稀釋測定,但應重新摸索酶標抗原的濃度,以確保方法的靈敏性。

          4.  以酶標記抗原的方法同酶標記抗體。

          5.  其它注意事項同酶聯免疫間接法。

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