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          技術支持

          怎樣選擇合適的單、多克隆抗體及抗原?

          更新時間:2023-04-26   點擊次數:310次

          多克隆抗體(polyclonal antibody, pAb):用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物,可刺激機體多個B細胞克隆,產生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物,即多克隆抗體。單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體,稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術來制備,雜交瘤(hybridoma)抗體技術是在細胞融合技術的基礎上,將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。

          一、單多抗優缺點

          多克隆抗體

          1.多克隆抗體有助于放大低表達水平的靶蛋白信號;

          2.能識別多個表位;

          3.比單克隆抗體更能容許抗原中的微小變化;

          4.識別出與免疫原蛋白質具有高同源性的蛋白質,或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白;

          5.多克隆抗體通常是檢測變性蛋白質的首xuan;

          6.多表位通??商峁└鼮橛辛Φ臋z測。

          1.易于產生批次間差異;

          2.產生大量非特異性抗體,有時可能在某些應用中產生背景信號;

          3.不適用于探測抗原的特定結構域,因為抗血清通??勺R別多個結構域。

          單克隆抗體

          1.雜交瘤制得后,就成為了恒定的再生源,所有批次都將相同;

          2.切片和細胞染色造成的背景較低。

          3.具有特異性,適于分析測定中的一抗或檢測組織中的抗原,并且通常所產生的背景染色顯著低。

          4.同質性非常高;

          5.單克隆抗體的特異性能使其在混合物中和抗原高效地結合。

          1.可產生大量特異性抗體,但可能特異性過強;

          2.經過抗原的化學處理后比多克隆抗體更易于丟失表位。這可通過使用同一抗原的兩個或多個單克隆抗體進行補償。

          二、單抗和多抗的選擇

          如果對抗體的特異性要求高,用量較大或需要長期使用一致的抗體,制備的抗體應用要求多(WB/IP/IF/ICC等),可以選擇制備單克隆抗體。

          多克隆抗體的特異性較差,即使是使用相同的抗原制備多抗,不同批次間也會存在差異,因而在特異性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫檢測時,更容易造成背景,例如在WB 中有雜帶,在IHC 中背景較深等等。雖然還存在著交叉反應的問題,但由于多抗識別多個抗原表位,即使是有少數幾個抗原表位被破壞或者抗原構象改變,實驗的結果也不會受到影響。另外多抗需要免疫原的量大,如果免疫原制備困難,建議制備單抗。

          若對抗體的特異性要求不高,需要做沉淀和凝集反應的檢測性實驗或者只需做ELISA檢測,可以選擇制備多克隆抗體。

          多抗相比較單抗仍然有制備時間短、首ci制備成本低的特點,在一些情況下也是一種選擇。另外,在相同條件下,使用多抗可以提高檢測的靈敏度,對于豐度偏低的蛋白也更容易檢出。

          三、抗原的選擇

          抗原的選擇可以是天然蛋白、重組可溶蛋白、重組變性蛋白和多肽,抗原質量越高,最終制備高質量抗體的幾率也會越大! 目前抗體制備常采用重組蛋白或多肽作為抗原。

          常規情況下,重組蛋白作為抗原往往含有更多的抗原決定簇,既有空間表位,也會有線形序列表位,對于機體的免疫刺激也會相對充分一些,那么最終獲取應用面較廣的抗體幾率也會大很多,尤其是目的蛋白已證明有修飾或者復雜結構的,一般都會優先選擇重組蛋白。

          當然也有必須用多肽制備的,比如對同源家族某一個蛋白抗體的制備,同源性非常高的,需要找到特異性aa合成多肽,再或者一些修飾化抗體,需要在多肽合成階段定點修飾某些AA來制備抗體。

          抗原多肽選擇一般遵循如下基本原則
          1.盡可能是在蛋白表面;
          2.保證該段序列不形成α-helix;
          3.N,C端的肽段比中間的肽段更好;
          4.避免蛋白內部重復或接近重復段的序列;
          5.避免同源性太強的肽段;
          6.交聯可以交聯在N,C兩端,選擇依據就是交聯在對產生抗體不太重要的一端;
          7.序列中不能有太多的Pro,但有一兩個Pro有好處,可以使肽鏈結構相對穩定一些,對產生特異性抗體有益。

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