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          技術支持

          乙醇固定樣品DNA抽提和直接PCR實驗

          更新時間:2023-05-04   點擊次數:250次

            實驗概要

            本實驗從乙醇浸泡的魚苗中提取DNA,并利用直接PCR進行了鑒定。

            實驗原理

            在實際的研究工作中,野外取樣的地點一旦較為偏遠,受條件的限制,很難保證得到的樣品活體或能夠快速冷凍;另外,對一些稀有物種和瀕危種,鮮活樣品的采集十分困難,一般為了解決這些問題,常采用乙醇和甲醛固定的方法來處理樣品,再對樣品DNA 進行提取以及擴增。使用乙醇固定樣品具有硬化,固定,脫水作用,對組織滲透迅速,特別適合組織中核酸的保存,相比于甲醛等其它固定方法,此法更簡單,保存時間更長質量更好,也更加清潔無害。乙醇固定樣品主要應用于水產種質資源鑒定,醫院或獸醫病理樣品保存,法醫樣品保存等方面,在特定物種基因保護,生物多樣性,動物分子標記,司法鑒定等方面有廣泛的應用。

            Omega Bio-Tek 相應試劑盒既能夠快速有效的抽提得到乙醇保存多年的樣品基因組DNA,又可以利用直接PCR 系統,快速的對乙醇保存樣品進行PCR 鑒定,為您的研究提供最有力的工具。

            實驗材料

            乙醇浸泡的魚苗

            實驗步驟

            1. E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit

            1) 分別取45ul AT1 和5ul AT2 到0.2ml PCR 管中,混合均勻。對于有較多樣品需要操作的,可以先將AT1 和AT2 用量計算好,混合均勻后再分裝到每一管中。

            2) 取魚苗一條,在AT4 中浸泡約5-10min,濾紙吸干水份。

            3) 將魚苗浸沒在上一步準備的AT1 中56℃水浴或者PCR 儀上消化10-20min,中間可以渦旋混勻一次。

            4) 消化完后的PCR 管置于90℃水浴或者PCR 儀上5min,稍微冷卻后加入50ul AT3 渦旋混勻。

            5) 以上裂解液就可以作為PCR 的模板直接使用,PCR 體系中建議加入5ul 左右。

            6) 取5ul E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit 抽提得到的一條魚苗的DNA 作為模板,客戶提供的引物Y-30-R/F 作為引物,PCR 擴增。

            7) PCR 擴增程序:

            94℃ 2min;

            94℃ 30S 52℃ 30S 72℃ 40S 33cycles;

            72℃ 5min;

            25℃ forever。

            2. E.Z.N.A.? MicroElute? Genomic DNA Kit

            1) 稱量10mg 組織,加入200ul Buffer TL;

            2) 加20ul OB,55℃孵化至wan全降解;

            3) 13,000xg 離心2min,轉移上清至新管;

            4) 加220ul Buffer BL 渦旋混勻,70℃孵化10min;

            5) 加220ul 無水乙醇,最大速度渦旋15s;

            6) 將混合液過柱吸附,13,000xg 離心30-60s,棄濾液;

            7) 加500ul Buffer HB,離心;

            8) 700ul DNAWash Buffer(加乙醇);

            9) 13,000xg 離心2min,干燥柱子;

            10) 加25ul 70℃預熱的Elution Buffer 洗脫。

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