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          技術支持

          怎樣提高擴增效率和PCR的特異性?

          更新時間:2023-05-08   點擊次數:287次

          引物

          引物設計:引物長度適當,18-24mers,并保證序列獨te性,以降低序列在非目的片段中存在的可能性,但長度大于24核苷的引物并不意味著有更高的特異性,較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交,反而降低特異性,而且長序列比短序列雜交慢,影響產量; 引物濃度:引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。

          Mg2+

          較高的Mg2+濃度可以增加產量,但也會降低特異性。為了確定最佳濃度,從1mM到3mM,以0.5mM遞增,進行最適Mg2+濃度測定。

          退火溫度

          Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。退火溫度一般設定為比引物的Tm低5℃的溫度。合理的退火溫度為55-70℃。在理想狀態下,退火溫度應足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合。

          巢式PCR

          使用巢式引物進行連續多輪擴增,由于同兩套引物都互補的靶序列很少,巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性,從而提高PCR反應的特異性和靈敏度。

          遞減PCR

          通過在PCR的前幾個循環使用嚴謹的退火條件提高特異性。循環設在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始,然后每個循環降低1℃到2℃,直到退火溫度低于Tm 5℃。這樣,特異性最高的目的模板會被優先擴增,并在隨后的循環中繼續擴增占據優勢。

          熱啟動PCR

          通過抑制一種基本成分延遲DNA合成,直到PCR 儀達到變性溫度。最chang用的是熱啟動DNA 聚合酶,常溫時該酶活性被抑制,94-95℃加熱數分鐘后回復正?;盍﹂_始反應,這樣可以避免起始循環溫度下的非特異性擴增,大大提高了PCR反應的靈敏度及特異性。熱啟動PCR是除了好的引物設計之外,提高PCR特異性最重要的方法之一。

          PCR增強劑

          包括甲酰胺,DMSO,甘油,甜菜堿等,能構降低熔解溫度,從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結構區。

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