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          技術支持

          實驗室PCR產物的電泳以及純化分析

          更新時間:2023-05-08   點擊次數:279次

          實驗室PCR 產物的電泳及純化

          一、目的

          (1)了解PCR產物電泳與純化的原理。

          (2)熟悉和掌握PCR產物電泳與純化的操作。

          二、原理

          在PCR過程中,部分引物和dNTPs在Taq酶等因子的作用下以DNA模板為指導合成新的DNA分子,當然還有一部分的引物和dNTPs沒有完成所期望的任務,以小分子的形式存在于PCR產物混合液中,為了后續分子克隆的工作能夠順利進行,PCR產物就需要進行純化,以去除PCR產物混合液中殘留的Taq酶、BSA、Mgt+、引物dNTPs.buffer中的小分子以及非特異性擴增產物。

          通過電泳將所需要的PCR產物和其他分子分離,經過EB染色后,在紫外燈激發顯色下把目標條帶從凝膠中切出來,然后通過相應的緩沖液將其溶解,經異丙醇(乙醇)作用使得DNA分子沉淀,再通過在高速離心讓沉淀的DNA分子結(indin)在濾膜上,而后用洗脫緩沖eluton ut其從濾膜上洗脫下來就得到了純化的PCR產物。

          三、買驗材料、器材和試劑1.實驗材料

          有目標條帶的PCR擴增產物。

          2.實驗器材

          ①離心機;②2mL離心管;③移液器;④移液槍頭;⑤水浴鍋;⑥手術刀片;⑦紫外凝膠觀察儀;⑧密封盒;⑨防紫外線眼鏡;?橡膠手套;①分析天平;2離心管架;③1.5mL離心管;④水平電泳槽;⑤電泳儀;①⑥微波爐;⑦藍蓋試劑瓶;⑧帶有層析濾膜的離心管(QIA quickspincolumn)。

          3.實驗試劑

          ①PCR產物純化試劑盒(QIAGEN);②異丙醇;③瓊脂糖;④6X上樣緩沖液(loading-buffer) ;⑤1X TAE電泳緩沖液;⑥溴化乙錠(EB) ;⑦100bp DNA marker;⑧3M NaAc(pH值為5. 0)。

          四、操作方法

          (-)瓊脂糖凝膠電泳

          1.制膠

          準制腦膠模具,稱取128脂期,倒人藍蓋試劑瓶中,然后用量簡量取50mL 1x

          TAE電泳緩沖液倒人藍蓋瓶中。蓋緊瓶蓋,放人微波爐中,中火2~3min,待瓊脂糖wan全熔化后,取出藍蓋試劑瓶(取時要戴微波爐手套,以免被燙傷),于室溫下放置5~8min,將凝膠液緩緩倒入制膠模具中,插上樣品梳,于室溫下靜置20~ 30min。

          2.點樣

          將凝固好的瓊脂糖凝膠,放人加有電泳緩沖液的水平電泳槽中,取出樣品梳。然后加人15pL有目標條帶的PCR擴增產物+1.5pL 6X.上樣緩沖液(Loading buffer)的比例進行混合后,把混合溶液加人凝膠的樣品槽中,在合適的樣品槽中加人2μL100bpDNAmarker.

          3.電泳

          蓋好電泳槽蓋后,接通電源,120V電泳1h 20min左右(在凝膠中只有一排樣品槽的情況)。

          4.凝膠染色

          電泳完畢后,取出凝膠,放人裝有溴化乙錠的密封盒中,染色25min。

          (二)電泳后PCR產物純化

          找出電泳結果出現單一目標條帶的對應PCR擴增產物進行純化。具體步驟如下:(1)在2.0mL的離心管壁上寫上準備純化的PCR產物的相關信息,并稱重。

          (2)切下含目標片段的膠塊,切得盡可能小一些,把所得的膠塊放人2.0mL的離心管中。

          (3)稱量裝有膠塊的離心管重量,計算出膠塊的重量。

          (4)加入6倍體積的QG buffer到離心管中(100mg膠相當于100pL)。

          (5)將含有膠塊的離心管放人50°C水浴鍋中,溫育10min,至膠塊wan全溶解,為促進溶解,每2~ 3min振蕩離心管-一次。

          (6)膠塊全部溶解后,檢查混合液的顏色是否為黃色(與未溶解之前的QG buffer 的顏色相似,若混合液的顏色為橙色或紫色,加10pL 3M NaAc(pH值為5. 0)。

          (7)向離心管中加人1倍凝膠體積的異丙醇,混勻。

          (8)將溶液轉移人QIA quick spin column中,13 000rpm離心1min。

          (9)棄掉液體,加入750μL PE buffer ,靜置2~5min,13 000rpm離心.1min.

          (10)棄掉液體,13000rpm離心1min(空載離心,除去乙醇)。

          (11)把QIA quick spin column置于一一個潔凈的1. 5mL的離心管中。

          (12)加人30pL的elution buffer置膜中央,13000rpm離心1min。(13)將洗脫所得溶液置于一20°C中儲存。

          所得到的洗脫液可與克隆載體進行連接,然后轉化使重組DNA分子進人大腸桿菌細胞內,經過培養獲取克隆子。

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