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          技術支持

          【細胞培養】還有誰不會細胞爬片制備?

          更新時間:2023-07-25   點擊次數:277次

          細胞爬片是一種將細胞培養在玻璃或塑料表面上,使其附著并擴展的技術。這種技術可以用于觀察細胞形態、細胞運動、細胞-細胞相互作用等。我們在做免疫熒光(IF),激光共聚焦(Confocal),凋亡檢測(TUNEL)時,免不了要制備細胞爬片,爬片質量wan全決定了最后拍照的質量以及實驗數據的精準性。今天,遠慕生物就教大家如何制備好的細胞爬片。

          爬片的準備

          1.爬片可用一般的蓋玻片,也可用專用細胞爬片(價格比較昂貴)但是細胞貼壁牢固,拍出照片效果好;

          2.可根據自己的需要,到染色時再將之切開,這樣既保證了細胞均一性,又可同時做幾個指標的染色剪裁成合適大小,置于6孔板、12孔板或24孔板;

          細胞爬片(以常用24孔板為例)

          1.胰yi酶消化細胞后計數重懸細胞于wan全培養基中。

          2.加細胞時,根據玻片的大小,先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養基,目的是使玻片與培養皿靠培養基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細胞懸液時玻片漂起,造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作,玻片是無菌處理的,可以酒精燈外火焰附近做。

          3.根據自己的需要,選擇合適的細胞密度(細胞太密影響拍照效果),將計數分好的細胞混勻后鋪到孔中,種入24孔板一個孔內即可。

          4.待細胞貼壁后,可去上清加處理組培養基。

          5.按照實驗設計,作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養皿底結合較緊,張力較大,小編會將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h,48h,72h等不同時間點實驗的話,將所需數量的爬片取出時應用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。

          爬片細胞的固定處理,以下為常用的固定液:

          1.冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

          將純丙酮預先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(此溫度不會為固體的)細胞爬片取出后,PBS洗2遍,加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強的揮發性,注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴,防止其揮發)固定10min。取出后,室溫吹干,然后放入-20℃保存。

          2.多聚甲醛(常用4%):避光保存,可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 室溫固定15-30min后,將表面液體吹干, -20℃保存

          3.95%乙醇,可用于免疫組化。

          優點:穿透性強、抗原性保存較好。

          缺點:但醇類對低分子蛋白質、多肽及胞漿內蛋白質保存效果較差,使蛋白變性的作用輕,固定后可再溶解;染色過程中,孵育時間長,抗原可流失而減弱反應強度。室溫固定15min后,將表面液體吹干,入-20℃保存

          4.甲醛

          優點:形態結構保存好,且穿透性強,

          缺點: 甲醛放置過久可氧化為甲酸,使溶液pH降低,影響染色; 分子間交聯形成的網格結構可能部分或完wan全掩蓋某些抗原決定簇,使之不能充分暴露??稍斐杉訇幮缘娜旧Y果。

          我們將以多聚甲醛為例,講講24孔板內,細胞爬片固定步驟:

          1.準備多聚甲醛(PFA): 4℃冰箱保存。

          2.將細胞從37℃培養箱取出,用預溫的PBS洗3遍,每次加入1ml PBS,輕輕晃動,避免將細胞沖掉。

          3.注意爬片的細胞面向上,每孔用4℃的多聚甲醛500ul即可,室溫固定30-40min,避光。

          4.固定后,用PBS洗三次。

          5.0.2-0.5%Triton X-100透化10-20min,覆蓋細胞即可。

          6.PBS洗三次。

          7.如果是做免疫熒光后續用3%的BSA,用PBS配置,封閉1h。

          8.封閉后,用PBS洗三遍,按比例加入一抗,4℃過夜,若轉入熒光標簽的質粒,要避光。

          9.過夜后,用預溫的PBS洗細胞,動作輕緩,可多洗一會兒,可以用慢搖床搖。

          10.加入用3%BSA稀釋的二抗,室溫孵育1h,避光。

          11.孵育結束后,避光用PBS洗3次,動作輕緩,可以多洗一會兒。

          12.1ug/mL DAPI ,室溫避光,染細胞核DNA 20min。

          13.PBS洗三次。

          細胞爬片封片

          1.將載玻片洗好在干凈無塵紙上晾干 。

          2.將PBS中的細胞取出,注意細胞面朝下,載玻片上滴入亮甲油,或者防防猝滅封片劑,蓋在載玻片上(市面上可以買到封片防猝滅劑)。細胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后做固定。根據研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡TUNEL染色時就避免洗,凋亡細胞在洗的過程中可能會脫落。

          3.保存細胞爬片時,一般用培養皿或避光濕盒,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實驗時取片。然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標記,為避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照沒有問題的。


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