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          技術支持

          組織RNA提取和培養細胞RNA提取總結

          更新時間:2023-11-08   點擊次數:44次

            一.組織RNA提取

            1.最好新鮮組織,這樣RNA提取的效果比較好,這是肯定的。

            2. 如果不是新鮮的(最好在半年之內,-80℃或者液氮中凍存的)組織,注意不要反復凍融,從冰凍狀態拿到0-4℃,注意不要拿到常溫,待組織解凍后,用 DEPC泡過的剪刀剪一小塊組織,稱重后,放到預冷的勻漿器中,然后加入一定量的TRIZOL試劑,然后勻漿。

            注意:速度不要太快,要勻一會挺一會,否則由于摩擦產熱,RNA遇熱會加速降解。如果一次做多個標本的RNA提取,也要這樣做,更不能急。后面的步驟和細胞RNA提取一樣。

            二.培養細胞的RNA提取

            1.貼壁細胞,需要先用胰酶消化后,然后收集到離心管中,離心,去上清,然后用PBS多洗2-3次,以去除多余的胰酶。

            懸浮細胞,直接用吸管或者加樣槍吹打評壁,以使細胞基本可以被吹下來。然后離心去上清,不需要用PBS洗。

            2.然后將少量細胞懸液轉移到預冷的DEPC泡過的1.5毫升EP管中,然后加入一定量的TRIZOL(細胞多的話加1毫升,細胞少的話加0.5毫升就可以),然后用槍頭吹打混勻5-10分鐘。(如果有時間就繼續往下做,如果沒有時間,可以把加了TRIZOL后的細胞裂解液凍存到-80℃,用的時候提取和新的提取的效果一樣。)在冰上操作。

            3.上面的混勻5-10 分鐘,基本可以使細胞裂解,然后可以進行下面的步驟,詳細的步驟我就不介紹了。

            注意事項:

            1.一定要注意冰上操作,低溫離心。

            2.戴口罩和勤換手套,去任何東西都要帶著手套去取。

            3.每次去器材的時候都要用鑷子去夾,鑷子要在酒精燈上燒一下。

            4.所有的器材都要經過DEPC浸泡后高壓后才可以使用,所需要的氯仿,酒精,異丙醇等都保證沒有被RNA 酶污染,不能用沒有泡過DEPC的槍頭去提取液體,一定要用DEPC浸泡過的槍頭去吸,如果發現試劑有可能被污染了,要立即更換。

            5. 吸取上清一定不要吸到中間層的蛋白,如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提,因為,吸到的蛋白很可能會對RNA產生降解作用。一定要少吸,不要貪多,RNA提取不要求量,更多的要求質。

            6.最后用75%的酒精洗一次就可以,盡量減少RNA提取時間。

            7.最后一步,用 DEPC水溶解RNA,不要用太多的體積,以保證RNA的濃度。

            8.提取完后,電泳觀察結果,如果上面的兩條帶都比較清楚的話,說明RNA提取的不錯,可以一次多逆轉錄幾管,不要把RNA凍存,以后在逆轉錄的效果不好。

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